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Biologia molecular

O que é a Hibridização in situ

30/06/2003

O que é a hibridização in situ?

Hibridização in situ

A hibridização in situ é uma técnica baseada na detecção de pequenos segmentos de DNA ou RNA a partir de "sondas" específicas. 

As sondas são seqüências de nucleotídeos complementares desenvolvidas a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar. 

Para permitir a visualização da reação entre as moléculas de DNA ou RNA em estudo e as sondas, estas podem ser associadas a moléculas radioativas, fluorescentes ou biotiniladas (esta última de forma semelhante à técnica de imuno-histoquímica).

 

Figura 1: Esquema do mecanismo de ação das técnicas de hibridização. hibri1.gif (3051 bytes)

Exemplificando o esquema acima: 3 pessoas (A, B e C) têm suspeita clínica de estarem infectadas pelo papilomavírus humano (HPV). Como o genoma do HPV é conhecido, basta adicionarmos ao material obtido dos pacientes (biópsia ou esfregaço citopatológico) uma sonda complementar ao DNA do HPV. No material que houver presença do genoma do HPV vai haver reação, que será identificada na lâmina pelo patologista. Na figura acima, os pacientes A e B têm resultado positivo na hibridização in situ, enquanto que o paciente C tem resultado negativo.

A hibridização in situ uma técnica mais sensível que a imuno-histoquímica, porém inferior à reação da polimerase em cadeia (PCR), onde, além da identificação do DNA/RNA desejado, há sua amplificação, gerando um sinal mais intenso, logo permitindo a identificação de um número menor de cópias.

A hibridização "in situ" é utilizada principalmente para a detecção vírus (ex. diversos tipos de HPV, vírus de Epstein-Barr, vírus da hepatite B) e de outros agentes infecciosos em tecidos suspeitos de infecção, além de cromossomos e produtos da síntese celular. Pode ser realizada em material fixado em formol e incluído em parafina, bem como congelado ou preparados citológicos.

 

Informações adicionais:

foto.gif (1628 bytes) Fotomicrografias de Hibridização "in situ"

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A_he_hpv1A.jpg (84064 bytes) A_his_hpv1C.jpg (71249 bytes) Condiloma acuminado vulvar com marcação com as sondas para HPV tipos 6-11 (baixo grau). H&E (esq.) e HIS (dir.), AEC, 10x.
A_he_hpv1B.jpg (80393 bytes) A_his_hpv1A.jpg (71264 bytes) Condiloma acuminado vulvar com marcação com as sondas para HPV tipos 6-11 (baixo grau). H&E (esq.) e HIS (dir.), AEC, 10x.
A_his_hpvag1.jpg (68537 bytes) Lesão de colo uterino com marcação com as sondas para HPV tipos 16-18 (alto grau). HIS, AEC, 4x.
A_his_hpvag2.jpg (57010 bytes) Lesão de colo uterino com marcação com as sondas para HPV tipos 16-18 (alto grau). HIS, AEC, 25x.
A_his_hpvbg1.jpg (58866 bytes) Lesão de colo uterino com marcação com as sondas para HPV tipos 6-11 (baixo grau). HIS, AEC, 25x.
A_his_hpvbg3.jpg (55227 bytes) Lesão de colo uterino com marcação com as sondas para HPV tipos 6-11 (baixo grau). HIS, AEC, 25x.
Esfregaço de lesão de colo uterino com marcação com as sondas para HPV tipos 16-18. HIS, AEC, 40x.

 

A captura híbrida no diagnóstico do HPV

O novo teste da Digene Brasil, a captura híbrida II detecta os 18 tipos mais comuns de vírus do papiloma humano (HPV) que infectam o trato anogenital, determinando com exatidão a presença ou não de DNA de vírus dos grupos de baixo risco (6, 11, 42, 43 e 44) ou de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) de desenvolvimento de câncer. 

Estudos demonstram que a sensibilidade do exame de captura híbrida II (1.0 pg/ml DNA-HPV ou 0,1 cópias/célula) é muito superior à apresentada pela hibridização molecular in situ (300 cópias/célula) e é similar àquela de outros testes mais demorados, que se utilizam de radioisótopos ou que manipulam o DNA, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) 1, além de ser superior ao seu antecessor, a captura híbrida I 2

A utilização clínica do teste de captura híbrida II é controversa. Alguns autores advogam seu emprego como triagem de mulheres com diagnóstico citopatológico de ASCUS (células escamosas atípicas designificado indeterminado - atypical squamous cells of undetermined significance) ou lesões intra-epiteliais de baixo grau do colo uterino 3. Por outro lado, outros cientistas reconhecem a precisão do método, mas sugerem que ainda é cedo para uma definição de estratégia de triagem e recomendam a detecção do HPV como método de pesquisa 4.

 

Vantagens do método de Captura Híbrida II para HPV (Digene Brasil): 

  • maior valor prognóstico que o Papanicolaou, permitindo tratamento imediato;
  • aumento nos intervalos de acompanhamento;
  • diminuição do custo total do acompanhamento para o sistema de saúde;
  • utilização desde a triagem até o acompanhamento devido à sua eficácia;
  • substituição dos métodos complexos de amplificação além de ser mais fácil e seguro de realizar.

 

Informações sobre a coleta:

O exame é realizado a partir de material coletado da área suspeita de infecção utilizando-se kit apropriado, fornecido pelo laboratório. O kit é composto de um swab e um tubo plástico contendo uma solução ácida que digere qualquer outra estrutura (celular, proteínas, gorduras,etc.) que não seja DNA ou RNA e fragmenta a molécula de DNA em curtas seqüências de bases nitrogenadas para facilitar a hibridização. 

 

Referências bibliográficas:

1. Hybrid capture II, a new sensitive test for human papillomavirus detection - comparison with hybrid capture I and PCR results in cervical lesions. Clavel C; Masure M; Putaud I; Thomas K; Bory JP; Gabriel R; Quereux C; Birembaut P. J Clin Pathol, 1998 Oct, 51:10, 737-40.

2. Comparative evaluation of first- and second-generation digene hybrid capture assays for detection of human papillomaviruses associated with high or intermediate risk for cervical cancer. Poljak M; Brencic A; Seme K; Vince A; Marin IJ. J Clin Microbiol, 1999 Mar, 37:3, 796-7. 

3. [Use of molecular tests of human papilloma virus (HPV) as screening test for cervix cancer: a review]. Ronco G. Epidemiol Prev, 1999 Oct, 23:4, 372-7. 

4. [Natural course of HPV infection. Usefulness of HPV analysis in cervix diagnosis]. Milde Langosch K; Riethdorf S; Park TW. Pathologe, 1999 Jan, 20:1, 15-24.

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