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Clínica médica/Intensiva/Enfermagem

Marcadores em medicina Legal

25/11/2005

 

 

Marcadores inflamatórios aplicados à Medicina Legal

Guilherme Zanutto Cardillo; Mario Perez Gimene; Roberto Souza Camargo

 

Resumo

A presente revisão de marcadores inflamatórios objetiva acrescentar aos trabalhos já classicamente consagrados, as novas tendências investigativas no diagnóstico diferencial entre lesão vital e post mortem. A fronteira no conhecimento reside na compreensão detalhada do processo inflamação e cicatrização. Da análise circunstanciada da literatura, citocinas, matriz extracelular e marcadores genéticos constituem campo promissor de pesquisas.

De poucos minutos até 10h após a lesão, constituem marcador de vitalidade as aminas vasoativas (histamina e serotonina), as catepsinas, os inibidores da proteinase, a fibronectina, a prostaglandina PGF2a, as citocinas IL-1, IL-6, G-CSF e MRP-14, a proteína C5-b9 e, de linhagem celular, os neutrófilos. De 2h até alguns dias, pode-se utilizar enzimas (fosfatase ácida e alcalina, ATPase, esterases não específicas e aminopeptidases), a defensina e, celularmente, a adesão eritrocitária e a presença de macrófagos e, após alguns dias de estabelecimento da lesão vital, pode-se encontrar positividade para reticulina, síntese de DNA, macrófagos com grânulos de hemossiderina e as citocinas IL-2, MIB-1 e MRP-8.

No entanto, a maioria dos estudos foi realizada em feridas incisas cutâneas, necessitando de estudos mais abrangentes acerca da aplicabilidade dos diversos marcadores apresentados para outras localizações anatômicas bem como outros pontos da fenômenologia médico-legal acerca da transição vida-morte.

Introdução

O diagnóstico de vitalidade das lesões, a partir do século XX, ganhou outra dimensão com a evolução das técnicas de microscopia. Com os avanços na compreensão do processo cicatricial, bem como na reação inflamatória aguda nas últimas décadas, o presente estudo dos mediadores de reação inflamatória permite colaborar para a elucidação da maioria dos casos de vitalidade. Não obstante, a freqüência dos casos que se investiga, as diferentes reações que aparecem nos diversos tecidos e células continuam sendo um problema latente, sem resolução definitiva.

Segundo Fávero (4), interessa à justiça, grandemente, o diagnóstico diferencial entre as lesões em vida e post mortem, porque permite esclarecerem-se questões relacionadas à produção de traumas mortais ou não, acidentalmente ou não.

Em 1954, Strassman definiu reação vital baseando-se em uma definição prévia de Plenk de 1786 como "aquela quando aparece em tecidos e órgãos, sendo necessária a presença de células vivas". Vinte séculos antes, o médico romano Aulo Cornélio Celso (século I d.C.) descreveu os sintomas que caracterizam esta reação nas feridas cutâneas: calor, rubor, tumor e dor.

Uma das características dos tecidos vivos é a sua capacidade de responder aos estímulos externos. Quando o estímulo é uma agressão traumática (biológica, física ou química), a reação tissular consiste em uma resposta constituída essencialmente por uma reação inflamatória aguda, geralmente proporcional à magnitude da agressão. Tal fenômeno foi descrito por John Hunter em 1873 como "a inflamação é um efeito destinado a restaurar a função normal, não devendo ser considerado uma enfermidade, mas um processo benéfico que se produz pela atuação de uma agressão".

A reação inflamatória é um fenômeno complexo, ainda não totalmente conhecido, constituído por vários processos encadeados (bioquímicos, celulares, vasculares) que se situam dentro de um objetivo comum de destruir a agressão e reparar o dano produzido. Mas, no entanto, a reação inflamatória inclui outros fenômenos que não são considerados elementos de resposta inflamatórios strictu sensu, como agregação plaquetária, ativação do complemento, ativação das prostaglandinas etc. O processo cicatricial, objetivando o reparo tecidual, decorre de uma seqüência complexa e organizada de eventos, envolvendo uma modificação consecutiva nas proteínas da matriz extracelular (MEC), através da liberação de fatores de crescimento, citocinas e fatores estimuladores. Durante este processo, no caso da cicatrização da pele, a migração de queratinócitos ocorre de tal forma a formar uma nova camada e um leito provisório é construído, por meio de síntese de proteínas da matriz extracelular (fibrina, fibrinogênio, fibronectina, tenascina e vitronectina) (1,3,17).

Do exposto, objetivamente, reação vital compreende todos os complexos processos que se ativam no tecido vivo perante a agressão, não ocorrendo no tecido morto.

Diagnóstico de vitalidade nas lesões

Thoinot, grande mestre da Medicina Legal, destaca especial atenção às lesões produzidas após a morte e suas diferenças com as de origem vital. Em relação à patologia forense, inúmeros são os casos para aplicação do diagnóstico diferencial in vivo versus post mortem, observando-se características distintas de ambas as fases.

Se a lesão é produzida quando o indivíduo estava vivo, produzir-se-á uma reação celular, constituída por uma resposta inflamatória aguda, que se revelará pelos clássicos sinais de Celso. Se a lesão foi produzida depois da morte, não ocorrerá lesão vital.

Legrand du Salle diferencia as lesões vitais através de diversas características, dentre elas as bordas das feridas ficam aumentadas (por edema), ocorrendo infiltração de sangue e separação pela retração da derme e tecidos subjacentes. Posteriormente, ocorrerá presença de exsudato e supuração. Haverá hemorragia abundante inicialmente, com infiltrado de sangue nos tecidos adjacentes. Posteriormente, encontra-se sangue coagulado no fundo da ferida e na pele. Já as lesões post mortem se caracterizam por bordas das feridas brancas, não edemaciadas, aproximadas, não havendo retração tecidual. Não ocorre exsudação ou supuração, bem como não haverá hemorragia arterial ou venosa, infiltração nos tecidos ou coagulação sangüínea.

Porém, o problema surge quando a ferida se forma nos momentos próximos à morte. Os limites entre a vida e a morte não são exatos. Os tecidos e órgãos reagem de forma diferente à anóxia, com características diferentes em virtude de múltiplos fatores, como temperatura ambiente, presença de circulação colateral ou trminal, da causa da morte, duração da agonia, terapêutica administrada nos últimos momentos de vida, mas nunca de forma imediata. Assim, a estimativa do tempo da ferida no intervalo pós-traumático imediato é dificultado devido a reações supravitais e a mudança morfológica mínima neste período (4).

Se o corpo sofre algum tipo de agressão durante este processo, os tecidos reagirão de maneira semelhante à descrita anteriormente, conhecida como reação vital. É o que se chama de reação agônica ou reação intermédia, termos que pela sua indefinição, revelam a imprecisão da própria reação produzida.

Nestes casos, o simples exame macroscópico não é possível. É o que levou Tourdes a formular a existência de um Período de Incerteza Diagnóstica, que quantificou em 6h antes e 6h depois da morte.

Marcadores de vitalidade

Amberg (2), em estudo de lesões cutâneas utilizando interleucina 1(IL-1), interleucina 6 (IL-6) e fator estimulador de leucócitos granulares (G-CSF) como marcador de fase imediata, interleucina 2 como marcador de fase tardia e como marcador de proliferação celular e estimulação macrofágica os anticorpos de proteínas de fase-S (MIB1), marcador de estágio inflamatório agudo macrofágico I e II do complexo L-1 (MRP 8 e MRP14, respectivamente) e moléculas secretadas por neutrófilos maduros contra agentes microbianos (defensina), caracterizou a ocorrência de citocinas com o tempo de lesão, a partir de autópsias. O resultado pode ser visto no tabela 1:

Na literatura, observam-se vários tipos de métodos e marcadores para aplicação do diagnóstico diferencial de vitalidade e post mortem (8). Para facilitar o estudo, pode-se dividir, didaticamente, em grupos analisando aspectos macroscópicos e microscópico das lesões ou de acordo com a técnica empregada.

Exame Macroscópico

Quanto ao Exame Macroscópico, Hoffmann e Haberda, em 1909, elencaram os sinais macroscópicos da resposta inflamatória aguda e que permite configurar a resposta vital do tecido, importantes como a hemorragia, o coágulo, aspiração do sangue, corpo estranho etc.

  • Hemorragia: ocorre nos tecidos agredidos na maioria das lesões em vida. Contudo, em alguns casos, pode não aparecer, como em feridas puntiformes, lesões por arrancamento ou torção (em que o traumatismo se encarrega de realizar a própria hemostasia) ou a existência de grandes hemorragias internas e, até mesmo em momentos após a morte, em locais de hipóstases (4).
  • Coagulação do sangue: há anos, sabe-se que o sangue derramado em vida se coagula rapidamente, formando uma rede de fibrina organizada, que pode ser evidenciada por vários métodos, ocorrendo até 6h após a morte. Já na morte com algumas horas de evolução, o sangue derramado não se coagula ou ocorre de forma parcial. A "prova do lavado" consiste em direcionar um jato fino de água e com pouca pressão. No coágulo formado em vida, não há desprendimento dos tecidos; ocorre deslocamento se for um coágulo post mortem.
  • Retração dos tecidos e reabsorção do sangue: só os tecidos vivos apresentam a capacidade de elasticidade e de desenvolver fenômenos de reabsorção de sangue. A retração é verificada principalmente na pele e nos músculos. Tendo papel importante, em vida, nos cotos arteriais, no intuito de efetuar, através da contração, hemostasia. No cadáver, tal retração falta ou pode estar reduzida ao mínimo. Sua presença tem valor diagnóstico absoluto, mas se a lesão ocorrer momento antes da morte, os resultados podem ser discutíveis.
  • Equimoses: a evolução cronológica das equimoses pelo colorido próprio é elemento diagnóstico para as lesões vitais, não ocorrendo post mortem.

Exame Microscópico

O Exame Microscópico, realizado inicialmente com microscópio óptico e atualmente, com o auxílio de diferentes tecnologias (microscópio eletrônico, eletrônico de varredura), associado à evolução na elaboração de corantes, como no emprego de técnicas imunohistoquímicas ou de imunofluorescência, tem permitido o desenvolvimento de amplos número de marcadores de vitalidade que permitiram a redução dos casos no "período de insegurança". São os seguintes:

  • Reação leucocitária: praticamente todas as reações inflamatórias se caracterizam pela presença de leucócitos no foco flogístico. Sob condições normais, os leucócitos são mantidos no centro dos vasos sangüíneos, onde o fluxo é mais rápido. Nos locais inflamatórios, com a vasodilatação local, o fluxo circulatório mais lento permite que os leucócitos se movam para fora do eixo vascular e interajam com o revestimento endotelial, agora alterado com inúmeras moléculas de adesão que, ao interagir com famílias específicas de receptores celulares, possibilitam a adesão leucocitária (em particular monócitos e leucócitos polimorfonucleares), facilitando a diapedese (3). O primeiro sinal da reação inflamatória é a presença dos leucócitos, mas não é absoluto para determinar reação vital, pois nos primeiros momentos da morte ainda pode ocorrer a presença dos leucócitos na ferida. Pode ser realizada a prova de Verderau, consistindo na comparação da relação existente entre glóbulos brancos e vermelhos de uma lesão (em vida ou depois da morte) com a relação existente em outra região qualquer (4). Com este marcador, os últimos estudos mostram que o período de insegurança pode ser menor, pois os leucócitos aparecem em feridas vitais com 3h de evolução e que os leucócitos não aparecem após este período.
  • Desintegração de glóbulos vermelhos: após ocorrida a lesão, tem-se hemácias no centro e periferia da lesão, sendo que nesta se inicia seu processo de desintegração. A hemólise ocorre com velocidade variável. Primeiro se modifica a forma normal, depois ocorre o "inchaço" da hemácia para, a seguir, a membrana sofrer alterações estruturais até ocorrer sua destruição. O tempo que decorre para definir as fases descritas depende do corpo da vítima, da lesão, do meio ambiente e outros fatores, podendo demorar horas a dias. A microscopia eletrônica é um método eficaz para o estudo do comportamento e da evolução da desintegração das hemácias.
  • Troca da hemoglobina: ocorre uma degradação que culmina com a quebra molecular. Inicialmente tem-se a hemossiderina, que, com a presença de ferro livre, pode ser vista a coloração azulada esverdeada até cinco dias. Depois, tem-se a bilirrubina, que ocorre do 12o ao 60o dia após a lesão.
  • Troca da trama capilar: observa-se atualmente que após 3h de lesão se inicia neovascularização capilar, com a formação anastomoses recém estabelecidas no foco da lesão com as margens da ferida, achado que não ocorre na lesão post-mortem.

Marcadores bioquímicos

  • Atividades enzimáticas: ocorre interesse crescente a partir de estudos realizados por Jirky Raekallio, em 1960. Duarte, em 1991, assinalou que as alterações morfológicas da resposta inflamatória estão precedidas e acompanhadas por alterações funcionais. Tem-se uma série de enzimas contidas nos lisossomos e nos componentes celulares que intervêm neste processo, o que se traduz num aumento de sua atividade no local da reação inflamatória, enquanto que na zona de necrose e regeneração o efeito é o contrário. Raekallio utilizou técnicas de imunohistoquímica direcionado para enzimas (fosfatase ácida, fosfatase alcalina, arilaminopeptidase, esterases, adenosinotrifosfatase) para estudar o comportamento e demonstrar a sua troca e sua atividade ao redor das feridas vitais, o que não ocorre nas feridas post mortem. As esterases e adenosinotrifosfatases aparecem na periferia da lesão cerca de 1h após estabelecida a ferida, a aminopeptidase aparece após 2h, a fosfatase alcalina após 4h e a fosfatase ácida aumenta após 8h. Desta forma, Raekallio criou o quadro temporal biológico, permitindo concluir-se:
  • As reações enzimáticas presentes nas feridas são indicadores específicos de vitalidade;
  • As experiências realizadas em diferentes partes do corpo apresentam o mesmo resultado;
  • Os resultados não se alteram em relação ao período transcorrido desde a morte e o momento da determinação enzimática (em material de autópsia, de um a cinco dias).

Do ponto de vista da biologia celular, as enzimas presentes nos grânulos de lisossomos podem ser utilizadas como marcador de vitalidade. Em estudos com material decorrente de contusões, as enzimas aparecem no segundo dia parmanecendo positivas até o quinto dia. As catepsinas são enzimas digestivas lisossomais (peptidases), sendo identificadas até o momento catepsina A, B, C, D e E. A catepsina D é a mais abundante, dado sua ativação no foco da ferida, sobretudo na região de necrose perilesional, pela diminuição do pH após período de hipóxia. Através de determinação espectrofotométrica, permite o reconhecimento de vitalidade 5 minutos após o início da lesão, atingindo um pico cerca de 20 minutos, mantendo-se em concentração estável dos 30 à 120 min (12), o que não foi observado em tecido post mortem. A partir da lesão vital, foi observada sua estabilidade em até 72h post mortem.

  • Inibidores da protease: a despeito de não se conhecer exatamente o papel dos inibidores da protease, sabe-se que esta classe bioquímica controla uma variedade de eventos associados ao reparo do tecido conjuntivo, fibrinólise e ativação do complemento. Este fato possibilita, ao menos teoricamente, a utilização como marcador em locais em que a reação inflamatória está se desenvolvendo. Vieira e colaboradores (19) estudaram sete diferentes tipos de inibidor da protease: alfa-2-macroglobulina (A2M), alfa-2-antiplasmina (A2AP), alfa-1-anticromotripsina (A1ACT), inibidor de C1 (C1INI), interalfatripsina (IAT), antitrombina III (ATIII) e alfa-1-inibidor da protease (A1Pi) em lesões cutâneas. Tem-se resultados de quatro deles: A2M, A2AP, A1Pi e ATIII. A especificidade foi alta para os inibidores estudados; a sensibilidade permaneceu elevada para A2M e A2AP e menos de 50% para ATIII e A1Pi. O valor preditivo positivo para todos foi alto, ou seja, pode-se afirmar que é altamente provável que uma lesão diagnosticada como vital seja de fato vital. No entanto, o reverso não ocorre. Isto é, uma lesão não vital sendo efetivamente post mortem não pode ser afirmada, já que valores preditivos negativos ficaram ao redor de 70% para A2M e A2AP e particularmente baixo (cerca de 21%) para ATIII e A1Pi. Os autores concluem que os melhores resultados para o diagnóstico diferencial entre lesão vital e post mortem foram obtidos com A2M e A2AP, mostrando ainda maior aumento em sua concentração após 5 minutos da incisão vital.
  • Aminas vasoativas (histamina e serotonina): a histamina é tida como marcador de fase imediata da inflamação, responsável pelas trocas vasculares, ocorrendo após cerca de cinco minutos da lesão enquanto que a serotonina está presente nos exsudatos inflamatórios, ocorrendo após 15 minutos de lesão (18).
  • Catecolaminas: a noradrenalina é detectada até 60 minutos antes da morte; contudo, o rápido desaparecimento da fluorescência (8-16h) impede a sua utilização regular.
  • Prostaglandinas: têm sua origem a partir de fosfolípides de membrana (fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina). Com a hidrólise pela enzima fosfolipase A2, ocorre liberação do araquidonato, substrato metabólico para diversos sistemas enzimáticos, como a via das ciclooxigenases, das várias lipooxigenases ou o citocromo P450. As prostaglandinas e os tromboxanos são os produtos da metabolização do ácido araquidônico pela via da ciclooxigenase. As prostaglandinas das séries D e E são produtos das prostaglandinas G, enquanto que a prostaglandina F é produto da prostaglandina H. As principais classes de prostaglandinas são subdivididas de acordo com o número de ligações duplas nas cadeias laterais refletindo, geralmente, o ácido graxo precursor. Assim, as prostaglandinas derivadas do araquidonato levam o número 2 e constituem a principal prostaglandinas nos mamíferos. A função fisiológica das prostaglandinas é vasto. Para detalhes, vide Goodman & Gilman (15). Sob o escopo deste trabalho, interessa a função como mediadores tardios de reação inflamatória. As prostaglandinas F (PGF) e prostaglandina E (PGE) apresentam ação vasodilatadora, estudada em queimaduras de pele e com níveis elevados (até 100%) em feridas vitais de 10 a 60 minutos de evolução. Em estudo de Vieira e colaboradores (19), PGF2a não foi detectada no grupo-controle, onde a pele estava intacta. Por outro lado, em amostras de de cadáveres, com pequeno intervalo postmortem, foi detectado em pequena quantidade. Este autor conclui que os níveis de PGF2a em feridas cutâneas são significativamente afetados por uma série de elementos, como tempo decorrido após a morte e a retirada da amostra e o tempo decorrido entre o encaminhamento da amostra e o processamento. Estes autores ressaltam que as técnicas empregadas na dosagem envolvem alto custo, além de complexa e uso de material altamente especializado, inviabilizando a praticidade e a utilidade deste marcador como elemento no diagnóstico diferencial.
  • Íons: mediante espectofotometria de absorção, foi possível comprovar a utilidade da determinação dos níveis de diversos íons (cálcio, magnésio, cobre, zinco, ferro, sódio e potássio) como marcadores de vitalidade, em particular cálcio, ferro e magnésio. Nas feridas com evolução de mais de 6h, encontra-se positividade para marcadores como cálcio e magnésio. No entanto, não foi comprovada utilidade em estabelecer a cronologia da ferida cutânea (19).
  • Marcadores da coagulação: o estudo da malha de fibrina e formação e posterior lise do coágulo tem sido muito utilizado para o diagnóstico da vitalidade.
  • Citocinas: são pequenas proteínas solúveis produzidas por uma célula que altera o comportamento ou as propriedades de uma outra célula, seja no local de produção, afetando a própria célula que o produziu (efeito autócrino), as células da vizinhança (efeito parácrino) ou células à distância (efeito endócrino). Às citocinas produzidas por linfócitos T é dado o nome de interleucina. As citocinas são liberadas por muitas células, incluindo células imunológicas, tendo sua função exercida de acordo com a ativação de receptores específicos e, no caso da resposta inflamatória, de acordo com a fase do processo cicatricial. São detectadas nos tecidos através de técnica imunohistoquímica. Como os trabalhos de marcadores de vitalidade utilizam como modelo feridas de pele, cabe uma breve revisão das fases da cicatrização bem como das citocinas envolvidas (3,7). Didaticamente, as fases são:

I – Fase inflamatória

II – Fase de formação de tecido de granulação

III – Fase de formação de matriz e remodelação

Amberg (2), em estudo de lesões cutâneas utilizando interleucina 1(IL-1), interleucina 6 (IL-6) e fator estimulador de leucócitos granulares (G-CSF) como marcador de fase imediata, interleucina 2 como marcador de fase tardia e como marcador de proliferação celular e estimulação macrofágica os anticorpos de proteínas de fase-S (MIB1), marcador de estágio inflamatório agudo macrofágico I e II do complexo L-1 (MRP 8 e MRP14, respectivamente) e moléculas secretadas por neutrófilos maduros contra agentes microbianos (defensina), caracterizou a ocorrência de citocinas com o tempo de lesão, a partir de autópsias. O resultado pode ser visto no tabela 1:

 

 

 

IL-1

IL-2

IL-6

G-CSF

MIB-1

MRP-14

MRP-8

Defensina

Controle

Cam. Epidérmicas +++

Apêndices cutâneos +

Cam. Epidérmicas ++

Apenas em algumas céls. na subcútis

Apenas nos ductos excretórios das glândulas sudoríparas

Estrato germinativo +++

Fibrócitos na camada reticular +

Cam.Epidér-micas ++

glândulas Sebáceas +

Algumas células na derme e na epiderme

Apenas no bulbo e no folículo piloso

Ao redor de apêndices na camada reticular

Supravital

Positividade intesticial difusa

Algumas células na margem da ferida

Como controle

Como controle

Como controle

Como controle

Como controle

Como controle

Como controle

1 a 2h

Como controle

Como controle

Como controle

Perda de reatividade

Como controle

Como controle

Reação aumentada nas margens da lesão

Expressão forte na borda da ferida

12h

Perda da reatividade epidérmica

Positivo no infiltrado intersticial

Ligeiramente positivo no estrato granuloso

Perda de reatividade na derme e epiderme

Fibroblastos únicos nas camadas reticulares e papilar

Sem reatividade

Aumento moderado da reatividade nas margens da ferida

Aumentado numericamente na borda da lesão

Infiltração parcial

Reação exacerbada na margem epidérmica

Moderada reticularidade

> 200h

Presente no tecido subcutâneo

Presente nas margens do tecido subcutâneo

Positivo em grupos de células ao redor da ferida

Fibroblastos únicos nas camadas reticulares e papilar

Positivo em grupos de céls. ao redor da ferida

Reatividade marginal

Ainda reatividade

Apenas reação moderada

Tabela 1. Expressão de citocina tempo-dependente no reparo de feridas cutâneas. A partir de Amberg (2)

MRP14: é uma proteína ligadora de cálcio (migration inhibitory factor related protein 14) presente na fase aguda da inflamação. É um antígeno encontrado em neutrófilos e monócitos, mas não é expresso em monócitos/macrófagos residentes. Está presente, portanto em granulócitos intravasculares, que se coram positivamente se não danificados, enquanto que no infiltrado inflamatório ocorre coloração intensa. É útil como marcador de fase precoce de agressão, antes da resposta celular efetiva (6).

Fieguth e colaboradores, estudando fragmentos de pele decorrente de ferida cirúrgica, através dos marcadores MRP8, MRP14 e Defensina, concluíram que a expressão positiva se dá em granulócitos presente em áreas de sangramento ativo em feridas inflingidas no momento da morte, bem como em reação com extravasamento de granulócitos para os tecidos não danificados ao redor. Reação positiva pode ser vista 20-30 min. após no espaço perivascular. Após 30-40 min. os anticorpos para os três marcadores coram granulócitos e macrófagos em porções extensas do estroma local. Em feridas acima de 12h a proporção entre macrófagos e outros tipos celulares envolvidos na cascata inflamatória foi pequena. Concluíram que MRP8, MRP14 e defensina não são úteis para apontar tempo da lesão em minutos a horas, devido demandar inflitração granulocítico, que demora 12h para ocorrer. Assim, o uso destes três marcadores não traz vantagem às técnicas histológicas consagradas para detecção de macrófagos ou granulócitos (5).

A Interleucina-1 é um polipeptídeo biológico produzido por macrófagos e fibroblastos, bem como por neutrófilos como resposta à infecção, lesão tecidual ou estímulos antigênicos. Há dois genes distintos para IL-1: IL-1a (alfa) e IL-1b (beta), ambos localizados no cromossomo 2, com apenas 26% de similaridade na seqüência de aminoácidos. Apesar disto, não há, aparentemente, diferença biológica entre eles. Os efeitos biológicos são: ativação de neutrófilos e fibroblastos, produção de febre (conjuntamente com IL-6 e TNFa (alfa) constitui os chamados pirógenos endógenos), estimulação de proteínas de fase aguda, além de efeitos endocrinológicos. Kondo et. al, ao estudar IL-1a (alfa), detectaram, através de técnica imunohistoquímica, no citoplasma de neutrófilos cerca de 3 a 6 horas após a ocorrência da ferida, permitindo a utilização como elemento de diferenciação entre fase inflamatória precoce e tardia (11).

A Matriz extracelular (MEC) é o principal componente do tecido conjuntivo. A diversidade de tipos de tecido conjuntivo advém de caracteres específicos ao tipo de colágeno que contém, sua quantidade e, mais importante, a outras moléculas que estão entrelaçadas (1,9). A MEC consiste em diferentes combinações de proteínas fibrosas e de substância fundamental. Substância fundamental é um complexo viscoso e altamente hidrofílico de macromoléculas aniônicas (glicosaminoglicanos e proteoglicanos) e glicoproteínas multiadesivas (laminina, fibronectina etc.) que se ancoram em proteínas receptoras (integrinas) presente na superfície da célula bem como a outros componentes da matriz, fornecendo força tênsil e rigidez à matriz (9). Segundo Montes (14), as fibras da matriz podem ser divididas em dois sistemas, de acordo com a sua natureza química: as fibras colágenas e as fibras elásticas.

As fibras colágenas se dividem em quatro tipos, de acordo com caracteres histológicos, ultraestrutura e nível de organização. O tipo I apresenta resistência à tensão, presente em tendões, fáscias, órgãos capsulados, camada adventícea dos vasos sangüíneos, epineuro etc. O tipo II apresenta resistência à pressão intermitente, presente e, cartilagem hialina e elástica. Tipo III está localizado no endoneuro, na túnica média das artérias, na camada muscular interna do intestino e na derme adventícea, tendo a função estrutural na manutenção dos órgãos expansíveis. O tipo IV, com função de suporte e filtração, por sua vez, está localizado em membranas basais (10,14).

As fibras elásticas incluem as fibras elásticas, fibras elaulínicas e fibras oxitalânicas. São encontradas nos tecidos conjuntivos que possuem capacidade elástica. Na pele humana, as fibras oxitalânicas são muito finas e estão dispostas perpendicularmente à junção derme-epiderme, ligando à membrana basal. Iniciam-se a partir de um plexo de fibras elaulínicas, as quais estão localizadas na interface entre a derme papilar e a derme reticular. Este plexo é paralelo à membrana basal e está conectado com as fibras elásticas finas da derme reticular (13,14).

Fibronectina (FN): na pele normal, a FN é encontrada na membrana basal da epiderme, dos anexos cutâneos, no endotélio e nas terminações nervosas. Ocorre coloração difusa na derme e na musculatura lisa do músculo eretor do pêlo (17).

Nas feridas decorrentes de trauma fatal, FN foi minimamente detectada como traços ou artefatos nas borda das das feridas. Nas áreas de sangramento ativo, FN foi fortemente positiva. Reação fortemente positiva pode ser demonstrada em feridas com ao menos 20 minutos de evolução. Após 40 min. redes amplas de FN foram detectadas em algumas amostras (5).

Segundo Ortiz-Rey e colaboradores (17), nos casos correspondentes à incisão, três padrões diferentes foram encontrados:

1) Uma faixa positiva na margem da ferida em continuidade com uma rede de fibras ramificadas na derme adjacente e, mais intensamente, na hipoderme;

2) Reatividade apenas na borda da lesão;

3) Negatividade ou coloração difusa esvaecida.

Os resultados denotam uma grande prevalência do padrão reticular nas feridas vitais (50%) vs. 0% em post mortem, com significado estatístico. Não foi possível, porém correlacionar a idade da ferida.

Tenascina (TN): reação positiva foi observada na membrana basal dos vasos sangüíneos e apendices cutâneos, ocasionalmente no músculo liso e raramente na derme papilar superior. A coloração para TN foi negativa em todos os espécimes post mortem (10).

A conclusão de Ortiz-Rey e cols. (17) é de que ambos marcadores são incontestavelmente positivos para determinar a vitalidade, mas tem uma baixa sensibilidade, sendo que os resultados podem ser afetados sobremaneira tanto por artefatos quanto por problemas técnicos. Assim sendo, pesquisa adicional deve ser feito para se determinar o que ocorre com feridas contusas ou queimaduras. Alertam ainda sobre a possível mudança no epítopo a ser reconhecido pelo anticorpo em decorrência da autólise, aumentando sobremaneira os resultados falso-positivo.

A proteína C5b-9 é uma proteína de reparo que, embora detectável posteriormente à fibronectina, aparece geralmente antes da reação celular. O tecido não lesado mostra positividade para este marcador nas camadas subendoteliais. As fibras danificadas mostram coloração intensa. Se positiva, apresenta valor indicando tempo de lesão maior que, no mínimo, 20 minutos (6).

  • Ácidos nucléicos: tanto o ácido ribonucléico (RNA) quanto o ácido desoxirribonucléico (DNA) constituem campo promissor de pesquisas na atualidade. Pode-se utilizá-los como marcador da cronologia da vitalidade, cmo marcador de reparo celular. Em trabalho avaliando a síntese de DNA e RNA na camada basal da epiderme após lesão, Oehminchen e cols. (16) relatam que o pico de síntese de DNA ocorreu após 30 a 72h após inflingida a lesão, enquanto que o RNA teve expressão máxima em 10 a 24h. Tanto no DNA quanto no RNA não foi detectada diferença entre lesão vital e postmortem. Porém, ressaltam os autores, por conta de o modelo utilizado ser animal sob condições controladas leva a dúvidas sobre a aplicabilidade em seres humanos.

Conclusão

Existem hoje vários marcadores para diminuir o período de incerteza diagnóstica, além dos já classicamente estabelecidos. As novas fronteiras no diagnóstico diferencial entre lesão vital e post mortem assestam-se no conhecimento das diversas etapas dos mecanismos inflamatórios e de reparo tissular. As diversas etapas de reparo podem ser detectadas nos tecidos através de técnica imunohistoquímica. A partir deste conhecimento, pode-se empregar novas técnicas laboratoriais na investigação da complexa trama de reparo. Da análise circunstanciada da literatura, citocinas, matriz extracelular e marcadores genéticos constituem campo promissor de pesquisas.

Dos novos marcadores de vitalidade já pesquisados, pode-se dividí-los em três grupos.

Um, de manifestação imediata, surgindo minutos após o estabelecimento da lesão e perdurando até cerca de 10h, incluem as aminas vasoativas (histamina e serotonina), as catepsinas, os inibidores da proteinase, a fibronectina, a prostaglandina PGF2a, as citocinas IL-1, IL-6, G-CSF e MRP-14, a proteína C5-b9 e, de linhagem celular, os neutrófilos.

Em médio prazo, ou seja, de 2h até alguns dias, como marcadores podem ser utilizados as enzimas (fosfatase ácida e alcalina, ATPase, esterases não específicas e aminopeptidases), a defensina e, celularmente, a adesão eritrocitária e a presença de macrófagos.

Tardiamente, ou seja, após alguns dias de estabelecimento da lesão vital, pode-se encontrar positividade para reticulina, síntese de DNA, macrófagos com grânulos de hemossiderina e as citocinas IL-2, MIB-1 e MRP-8.

No entanto, ressaltamos que a maioria dos estudos foi realizada em feridas incisas cutâneas, necessitando de estudos mais abrangentes acerca da aplicabilidade dos diversos marcadores apresentados para outras localizações anatômicas bem como outros pontos da fenômenologia médico-legal acerca da transição vida-morte.

A despeito da necessidade de laboratório compatível e, muitas vezes especializado, do mesmo modo que na clínica geral, na aplicabilide de diversas técnicas novas, os exames devem ser usados de acordo com a suspeita clínica e de acordo com sua evolução, otimizando os recursos institucionalmente disponíveis. Afinal, como disse Claude Bernard: "Quem não sabe o que procura não sabe interpretar o que acha".

Abstract

This revision about inflammatory markers has the aim of add to the works already consecrated, the new investigation in the differential diagnosis between vital lesion and postmortem. The border in the knowledge lives in the detailed understanding of the process inflammation and cicatrization. Of the analysis of the literature, citocinas, extracellular head office and genetic markers constitute promising field of researches.

Of minutes up to 10:00 after the lesion, they constitute vitality marker the vasoactive aminas (histamine and serotonin), the catepsinas, the inhibitors of the proteinase, the fibronectina, the prostaglandina PGF2a, the citocinas IL-1, IL-6, G-CSF and MRP-14, the protein C5-b9 and, of cellular lineage, the neutrofilos. Of 2:00 to some days, it can be used enzymes (acid and alkaline phosphatase, ATPase, esterases no specific and aminopeptidases), the adhesion eritrocitaria and the presence of macrophages and, after some days of establishment of the vital lesion, can meet assertiveness for reticulina, synthesis of DNA, macrophages with hemossiderina granules and the citocinas IL-2, MIB-1 and MRP-8.

However, most of the studies was accomplished in hurt cutaneous incisas, needing including studies concerning the applicability of the several markers presented for other anatomical locations as well as other points of the forensic concerning the transition life-death.

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