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O ESTUDO DA PROTEÍNA DE RESISTÊNCIA MÚLTIPLA ÀS DROGAS (P-GLICOPROTEÍNA) E O DESENVOLVIMENTO DE DROGAS QUE POSSAM INIBIR SUA AÇÃO.

CARLOS MAGNO GREGHI ⁽¹⁾ e MARIA CELIA P. RODRIGUES GREGHI ⁽²⁾

1- Farmacêutico da Divisão de Farmácia do Hospital Universitário Regional do Norte do Pr - UEL - Av. Robert Kock, 60 - Vila Operária - CEP 86038-350 - Londrina - Pr - greghi@sercomtel.com.br

2- Farmacêutica da Farmácia Inglaterra - Av. Inglaterra, 1042 - Jd São Vicente - CEP 86046-430 - Londrina - Pr

RESUMO

A resistência aos quimioterápicos é o maior obstáculo para o sucesso de uma terapia antineoplásica. Os problemas relacionados a resistência e as maneiras de superá-los ou mesmo explorá-los, constituem uma área de grande interesse aos oncologistas. Um transportador de múltiplas drogas ou P-glicoproteína (Pgp) desempenha uma função de desenvolvimento de resistência a uma grande variedade de drogas citotóxicas não relacionadas quimicamente, incluindo as antraciclinas (doxorrubicina e daunomicina), os alcalóides da Vinca (vincristina e vinblastina), actinomicina D, epipodofilotoxinas e paclitaxel. Este é um trabalho de revisão constituído de duas partes, sendo que, a primeira parte consiste na caracterização da Pgp, uma proteína de membrana plasmática da família dos transportadores ABC ( ATP Binding Cassete) codificada pelo gene MDR1 no cromossomo 7 em humanos que funciona como uma bomba de efluxo de drogas que depende de hidrólise de ATP. A segunda parte é relacionada ao estudo do desenvolvimento de drogas que inibem a ação da Pgp, como: bloqueadores de canal de Cálcio, antiarrítmicos, peptídeos hidrofóbicos, inibidores da proteína quinase, antibióticos, hormônios e flavonóides. Essas drogas podem inibir por competição ao transportador, por ligação ao NDB (Nucleotídeo Binding Domain) da Pgp ou inibindo a proteína Quinase C como o Safingol. Porém estes MDR moduladores podem interferir em outros processos celulares conferindo grande número de efeitos colaterais que limitam seriamente seu uso clínico. A descoberta de novos agentes com maior seletividade para Pgp deve ser facilitada pela caracterização bioquímica e farmacológica destes transportadores. A descoberta desses fármacos será muito útil como adjuvante da quimioterapia antineoplásica, uma vez que aumentaria a quimiossensibilidade das células cancerosas aos agentes citotóxicos.

INTRODUÇÃO

O Fenômeno de Múltipla Resistência a Drogas

Os oncologistas foram os primeiros a observarem que canceres tratados com várias drogas antineoplásicas tendem a desenvolver uma resistência cruzada para muitos outros agentes citotóxicos para o qual eles nunca tinham sido expostos, eliminando então a possibilidade de curar esses tumores com quimioterapia. Esta observação sugere que a resistência múltipla à drogas (MDR) é em muitos casos, mas não em todos, resultante de mudanças hereditárias nas células cancerosas causando alterações nos níveis de proteínas específicas, ou proteínas mutantes, que permitem as células cancerosas sobreviverem na presença de muitos agentes citotóxicos diferentes. Essas alterações genéticas que conferem resistência aos agentes neoplásicos podem afetar o ciclo celular, a susceptibilidade das células para apoptose, captação e efluxo de drogas, metabolismo celular das drogas, a armazenagem intracelular das drogas ou reparos de danos induzidos pelas drogas (normalmente no DNA).

O mecanismo melhor estudado de MDR é o que envolve a superexpressão de uma bomba de efluxo de múltiplas drogas dependente de energia, conhecida como transportador de múltiplas drogas ou P-glicoproteína (Pgp). Esta proteína pertence a super família de transportadores ABC (ATP Binding Cassete) que contêm uma fita altamente conservada, que é ligadora de ATP. Esse tipo de transportador está envolvido em outros processos como na fibrose cística e na resistência do protozoário Plasmodium falciparum, a droga antimalárica Cloroquina. O número de membros conhecidos da superfamília ABC de transportadores de células eucarióticas está aumentando rapidamente e as funções normais de alguns deles estão se tornando evidentes. A Pgp é uma proteína da membrana plasmática de 170 kDa e é codificada pelo gene MDR1 localizada no cromossomo humano 7. O gene MDR1 desempenha um importante papel na absorção e excreção de muitos agentes farmacológicos usados normalmente e xenobióticos, e eles tem uma função chave na regulação dos níveis celulares e teciduais desses agentes. Assim, estudos do transporte de drogas têm implicações importantes para entendermos o processo de transporte dependente de energia, assim como a farmacologia e toxicologia de muitas drogas e compostos ingeridos na dieta.

A ESTRUTURA DA P-GLICOPROTEÍNA

A codificação da seqüência do gene humano MDR1 tem permitido o conhecimento da estrutura secundária e do segmento transmembrana desta proteína o qual permitiram o modelo topológico da proteína figura 1.

Figura 1 - Um modelo hipotético bidimensional da P-Glicoproteína Humana, baseada na análise da sequência de aminoácidos e seus domínios funcionais (Adaptado de DI PIETRO A. et al, 1999)

Esta proteína é composta de 1280 aminoácidos e é constituída de duas metades homólogas. A análise de hidrofobicidade indica que cada metade contém um domínio hidrofóbico com seis alfa hélices transmembrana envolvida no efluxo de drogas quimioterápicas, e um domínio citossólico, o domínio ligante de nucleotídeo um (NDB1) e NDB2 o qual contêm o sítio que liga o ATP com característica Walker motifs A e B e a assinatura S típica do transportador ABC. A seqüência central que conecta as duas metades homólogas da proteína, é composta por uma cadeia flexível chamada "linker region" e contêm resíduos que podem ser fosforilados. A ligação e hidrólise do ATP parecem ser essencial para o funcionamento da Pgp incluindo o transporte de drogas.

Dados sugerem que as duas unidades da Pgp humana interagem para formar um transportador simples e que os domínios que ligam a maioria das drogas estão no ou perto dos domínios transmembrana 5,6 e 11,12. É claro também que ambos os sítios ligadores de ATP (NDB1e NDB2) são necessários para o desempenho funcional da molécula e que, de fato, a interação entre os sítios ATP e os domínios ligantes de drogas é essencial para o transporte.

O poro pode ser fechado pelos dois NDBs e pelas alças internas que conectam os segmentos transmembrana. A Pgp é sintetizada como um precursor não glicosilado , com a massa molecular em trono de 120-140 kDa. Na Pgp humana, todas as cadeias de oligossacárideos são N-glicosiladas, mas a natureza e a seqüência dos açúcares ainda não são conhecidas. A seqüência das Pgps de diferentes espécies tem permitido o conhecimento de dois a quatro sítios de glicosilação; o número exato e posição desses sítios diferem entre homens e roedores mas, estão sempre localizados na primeira alça extracelular (conforme fig.1). Porém o transporte das drogas e a atividade ATPase não são dependentes da glicosilação. Séries mutantes com os sítios de glicosilação alterados também mostram a mesma resistência cruzada à drogas. De qualquer forma a ocorrência muito baixa de linhagem de células resistentes sugere que a glicosilação pode contribuir para a inclusão e local preciso da Pgp na membrana plasmática.

A fosforilação da Pgp pode mudar a taxa de transporte. Estudos indicam que a "linker region" é perfeitamente acessível pelas proteínas quinases.

Figura 2 - Modelo tridimensional da PGP

O PAPEL DA P-GLICOPROTEÍNA NA FISIOLOGIA NORMAL

A identificação da Pgp como uma bomba dependente de energia, que poderia conferir resistência a compostos citotóxicos hidrofóbicos em células neoplásicas, levou a questão da função normal da Pgp. A primeira dica destas funções pode ser obtida de estudos no qual anticorpos monoclonais para Pgp são usados para localizar a proteína em tecidos humanos. Em células epiteliais do trato gastrointestinal mais baixo (jejuno, íleo e cólon), altos níveis de Pgp são localizados na superfície apical destes tecidos, que sugere uma função de prevenção na captação de substratos e talvez para facilitar a excreção através da mucosa do trato GI. Nos rins e fígado, a Pgp está presente na luz dos túbulos e na face biliar, das células dos túbulos proximais e dos hepatócitos levando a acreditar que a Pgp está envolvida na secreção dos xenobióticos e dos metabólitos endógenos na urina e na bile. Alguma Pgp é também encontrada na face apical dos ductos pancreáticos. Uma das mais interessantes localizações para Pgp é na face luminal das células de capilares endoteliais no cérebro e testes concluem que a Pgp participa na formação da barreira hematoencefálica.

Muitos outros tipos de células e tecidos expressam a Pgp. Existe Pgp na placenta que sugere um papel na proteção do feto contra xenobióticos tóxicos. Nos roedores, o endométrio gravídico tem glândulas que são muito positivas para Pgp e a córtex da adrenal também é rica em Pgp. Estas localizações em glândulas secretoras de esteróides sugerem que a Pgp pode estar envolvida na secreção de esteróides, ou na proteção da membrana plasmática de células secretoras de esteróides dos efeitos tóxicos das altas concentrações destes hormônios. Uma observação concordante com estes resultados é que a progesterona é um inibidor da Pgp, e outros esteróides, especificamente a corticosterona, são transportados por epitélios que expressam a Pgp.

Estudos recentes mostram que a Pgp é encontrada também em algumas células do sistema imunológico como células B, T e macrófagos. O seu papel fisiológico neste contexto ainda não é conhecido mas, alguns autores tem especulado que a Pgp está envolvida na secreção de citocinas endógenas. Se isto for provado então a manipulação dos níveis de Pgp poderá servir como uma ferramenta para alterar a função imunológica.

SUBSTRATOS DA P-GLICOPROTEÍNA

Células neoplásicas resistentes a múltiplas drogas são caracterizadas por um amplo espectro de resistência a agentes quimioterápicos e redução acentuada da acumulação intracelular destas drogas. Os substratos da Pgp (tabela1) por serem lipofílicos entram nas células por difusão passiva através da membrana plasmática. A resistência conferida as células é o resultado da taxa de influxo passivo subtraída da taxa de efluxo ativo mediado pela Pgp, porém também há alguma evidência que a Pgp pode diminuir o influxo de drogas citotóxicas na célula.

TABELA 1: Substratos de P-glicoproteína

INIBIDORES DE MDR

Um número grande de compostos não citotóxicos conhecidos como quimiossensibilizantes ou moduladores MDR sensibilizam as células resistentes para a ação dos agentes antineoplásicos. Estes inibidores da ação da Pgp incluem os bloqueadores de canais de cálcio, antagonista da calmodulina, esteróides, peptídeos cíclicos, e drogas análogas. Pesquisas estão sendo realizadas em vários laboratórios para se entender as bases funcionais e estruturais da inibição do transporte mediado pela Pgp por moduladores. Acredita-se que um entendimento mais claro dos sítios que ligam as drogas e o mecanismo pelo qual os moduladores possam inibir a função da Pgp levará ao desenvolvimento de quimiossensibilizantes melhores para o uso clínico.

A inibição do transporte de fármacos poderia potencialmente resultar do bloqueio do reconhecimento específico do substrato, bloqueio da ligação do ATP, da hidrólise de ATP ou do acoplamento de hidrólise de ATP e a translocação do substrato. Maioria dos agentes moduladores bloqueiam o transporte agindo com inibidores competitivos ou inibidores não competitivos e por se ligarem aos sítios de interação com as drogas ou outros sítios, que levam a mudanças alostéricas na proteína. Atualmente nenhum dos moduladores conhecidos inibe a ligação da Pgp com o ATP.

Inibidores como o verapamil são substratos para o transportador e portanto, inibem a função de transporte de um modo competitivo sem interromper o ciclo catalítico da Pgp.

Outros agentes moduladores como a ciclosporina A inibe o transporte por interferirem com o reconhecimento do substrato e a hidrólise de ATP. Muitos estudos indicam um papel da Proteína Kinase C (PKC) na regulação de MDR, uma vez que inibidores de PKC como o Safingol são capazes de reverter parcialmente a MDR e inibir a fosforilação da Pgp. Porém análise mutacional tem estabelecido que a fosforilação da Pgp não é essencial para sua função de transporte e provavelmente outros mecanismos podem estar envolvidos.

Devido a alguns dos moduladores da Pgp serem substratos para a bomba, altas concentrações destes compostos podem ser requeridos para potenciar a acumulação de drogas citotóxicas em células que superexpressam a Pgp. Também, a potência dos inibidores normalmente depende da droga citotóxica para a qual a resistência está sendo sensibilizada, por exemplo, o verapamil é um potente inibidor da resistência de daunorrubicina, paclitaxel, e vinblastina, enquanto a ciclosporina A é um melhor inibidor de resistência a colchicina.

ASPECTOS FARMACOLÓGICOS DA PGP

Muitas pesquisas têm contribuído significativamente para o conhecimento das relações estrutura atividade de modulados de MDR. Embora exista uma grande diversidade estrutural entre os modulados da Pgp para que nenhum consenso pudesse ser definido, em cada classe de drogas as relações estrutura/atividade têm feito o possível para definir certas características químicas destes compostos que parecem ser essenciais para interação funcional para a Pgp. A seguir alguns dos estudos serão apresentados resumidamente:

Colchicina:

Um estudo intenso sobre a colchicina e seus análogos com substrato da Pgp,  está sendo feito com o intuito de definir características essenciais que este alcalóide requer para um transporte eficiente pela Pgp.

Os grupos metoxi dos dois anéis aromáticos parecem ser dispensáveis para a interação com a Pgp, entretanto o átomo do grupo acetamida no C7 é crítico para o reconhecimento desta substância pela Pgp.

Verapamil:

Baseado na sua capacidade de reverter a resistência a doxorrubicina, o domínio estrutural chave de verapamil para interação com a Pgp, pode ser os grupos assinalados na estrutura abaixo. Como no caso da colchicina os grupos metoxi nos anéis aromáticos não são essenciais, para o efeito de inibição da MDR, similarmente o anel A parece ser dispensável.

Reserpina:

A reserpina possui forte efeito na inibição de MDR. O grupo trimetoxibenzoil é importante para aumentar a quimiossensibilidade para vinblastina. A disposição dos anéis aromáticos e dos anéis heterocíclicos nitrogenados também contribuem para sua atividade.

Propafenona e compostos relacionados:

Embora exista uma relação entre a lipossolubilidade e a atividade biológica da propafenona e outras moléculas relacionadas, modificações em posições críticas da molécula leva a uma diminuição da atividade, a qual não pode ser relacionada a mudança de solubilidade apenas. Nos compostos testados o grupamento fenilpropiofenona é importante para manutenção da atividade quimiossensibilizante para resistência de daunorrubicina e colchicina. A retirada de um dos anéis aromáticos mostra perda quase total da atividade. A diminuição da atividade pode ser observada também quando os carbonos entre os dois anéis aromáticos são removidos o que sugere que uma distância ótima deve ser mantida entre os anéis aromáticos. Muitas outras modificações estão sendo feitas na molécula de propafenona contribuindo para sua relação estrutura/atividade.

Fenotiazinas:

Substituições nos anéis de fenotiazinas que aumentam sua hidrofobicidade aumentam também sua atividade. Assim, o grupo CF₃ colocado na posição 2 são drogas mais potentes, enquanto a substituição pelo grupo OH diminui a sua atividade. A distância entre o grupamento amino da cadeia lateral e os núcleos dos anéis tricíclicos também é importante para o antagonismo de MDR. Somando-se a isso, o tipo de grupamento amino influencia significativamente a potência quimiossensibilizante.

Muitos outros compostos como as fenoxazinas, ciclopeptídeos, diidropiridinas, cloroquina, esteróides, flavonóides estão sendo submetidos a análise de estrutura atividade para se chegar a drogas mais efetivas.

Algumas características estruturais inibidoras de MDR foram identificadas. Por exemplo, o grupo CH2-CH2-N-CH2-CH2 foi encontrado na maioria dos compostos ativos, e a atividade é melhorada com a presença de grupos (di)metoxilfenil, enquanto a presença de sal de amônio quaternário e grupos carboxil, fenol ou anilina contribuem para a diminuição da atividade.

Os agentes inibidores de MDR que estão em experimentos clínicos estão longe de serem perfeitos, principalmente devido a sua toxicidade e potência ineficiente com as dosagens toleradas. Drogas mais potentes e menos tóxicas precisam ser desenvolvidas com urgência para uso clínico. Porém a solução deste problema é muito difícil pois, os mecanismos de MDR e inibidores ainda não estão bem entendidos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AMBUDKAR S V et al Biochemical, Cellular, and Pharmacological Aspects of the multidrug transporter. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v.39, p.361-398, 1999.

BORGNIA M.J. et al. Competition of hydrophobic peptides, cytotoxic drugs, and chemosensitizers on a common P-glycoprotein pharmacophore as revealed by its ATPase activity. The Journal of Biological Chemistry,v.271, n.6, p.3163-3171,1996.

DI PIETRO A. et al P-glycoprotein-mediated resistance to chemotherapy in cancer cells: using recombinant cytosolic domains to establish structure function relationships. Brazilian Journal Of Medical And Biological Research, v.32, n.8, p.925-939, 1999.

EYTAN G. et al. The role of passive transbilayer drug movemet in multidrug resistance and its modulation. The Journal of Biological Chemistry,v.271, n.22, p.12897-12902,1996.

GUPTA K. et al. Partial reversal of multidrug resistance in human breast cancer cells by an N-Myristoylated protein kinase C-alfa pseudosubstrate peptide. The Journal of Biological Chemistry,v.271, n.4 p.2102-2111,1996.

KLOPMAN G. et al. Quantitative structure-activity relationship of multidrug resistance reversal agents. Molecular Pharmacology, v.52, p.323-334., 1997.

LAVIE Y. et al Agents that reverse multidrug resistance, Tamoxifen, Verapamil, and Cyclosporin A, block glycophingolipid meabolism by inhibiting ceramide glycosylation in human cancer cells. The Journal of Biological Chemistry, v.272, n.3,p.1682-1687,1997.

SCALA S. et al. P-glycoprotein substrates and antagonists cluster into two distinct groups. Molecular Pharmacology, n.51, p.1024-1033,1997.

SEELIG A. A General pattern for substrate recognition by P-glycoprotein European Journal Biochemistry, p.251,252-261, 1998.

SUMIZAWA T. et al. Reversal of multidrug resistance-associated protein-mediated drug resistance by the pyridine analog PAK-104P. Molecular Pharmacology, n.51, p.399-405,1997.

ZHANG L. et al. Characterization of prenylcysteines that interact with P-glycoprotein and inhibit drug transport in tumor cells. The Journal of Biological chemistry,v.270, n.39, p.22859-22865,1995.