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biologia molecular

Replicação nas Extremidades Cromossômicas

04/06/2003

Por Francisco Prosdocimi

A replicação do DNA é realizada, nas células eucarióticas, por várias enzimas, das quais a mais importante é a DNA polimerase III, que produz fitas duplas de DNA a partir de DNAs de fita simples e de um iniciador (primer), composto de RNA. Esse primer é formado pela enzima primase e contém normalmente de 8-12 nucleotídeos. As enzimas DNA polimerases funcionam adicionando nucleotídeos complementares à fita molde na extremidade 3' do primer 14.

Portanto, uma das fitas de DNA é sintetizada de forma contínua (fita leading) e a outra é sintetizada de forma descontínua (fita lagging). Nessa última, a síntese ocorre através da ligação de fragmentos, chamados fragmentos de Okasaki. Para a síntese de cada um dos fragmentos é necessário um primer de RNA, o que faz com que a molécula resultante seja híbrida. A DNA polimerase I corrige o "erro", retirando os nucleotídeos e colocando os desoxiribonucleotídeos corretos 14. Então, a enzima DNA ligase liga esses fragmentos, proporcionando uma síntese correta.

Entretanto, nas extremidades cromossômicas, uma das fitas é copiada até o fim, enquanto, na outra, sempre sobra uma pequena região onde a primase não consegue se ligar para formar o primer Fig. 1. Mesmo se fosse possível que o último primer iniciador estivesse na extremidade final da fita lagging, ele deveria ser substituído por DNA pela DNA polimerase 1, mas não há extremidade 3’ livre para que a enzima haja.

Assim, a cada replicação do DNA, os telômeros tendem a ficar mais curtos e algo deve ser feito para que isso não ocorra.

Fig. 3
Problema da replicação nas extremidades cromossômicas. A fita lagging (de baixo) sempre fica com uma extremidade livre onde as enzimas não conseguem mais sintetizar o DNA.

Mecanismos de Manutenção do Tamanho do Telômero

O principal mecanismo de manutenção do tamanho do telômero é através do acréscimo de seqüências repetitivas pela telomerase. A telomerase é uma ribonucleoproteína (RNP), ou seja, ela consiste de uma parte protéica e de uma molécula de RNA. A observação de que o primeiro RNA isolado de uma telomerase (em Tetrahymena) era complementar à repetição telomérica do organismo em questão, sugeriu que o RNA poderia servir de molde para a replicação telomérica. Essa hipótese foi comprovada através de estudos de mutagênese, onde uma mutação no RNA da RNP provocou uma mudança correspondente na seqüência telomérica. As seqüências desses RNAs variam enormemente entre organismos distantemente relacionados tanto na seqüência, quanto no tamanho, que é de 159 bases em Tetrahymena, 450 no homem e 1,3Kb em levedura 12.

A clonagem do gene da subunidade catalítica da telomerase revelou, como era esperadas, uma homologia com transcriptase reversa. Portanto, a subunidade catalítica da telomerase foi chamada de TERT (TElomerase Reverse Transcriptase) 12.

A estrutura tridimensional de uma transcriptase reversa (RT) e, provavelmente, o de uma TERT é comparada com a estrutura de uma mão direita, com os dedos, a palma e o polegar. A fita molde o primer são presos na mão. Os domínios de transcriptase reversa estão nos dedos e na palma, sendo que o sítio ativo, definido como uma tríade de resíduos de aspartato, está localizado no domínio da palma. Entre diversas DNA e RNA polimerases observa-se que os domínios de dedos e palma possuem diversas arquiteturas diferentes, que podem estar relacionadas à diferença de especificidade ao substrato e ao papel biológico das enzimas. Os motivos Ts das TERTs são semelhantes e bastante diferentes do mesmo motivo das RTs e pode estar relacionado ao fato de que as TERTs carregam o seu próprio molde de RNA 12.

A princípio, achava-se que a telomerase catalisava a reação de elongação de uma das fitas do DNA utilizando seu molde e que após um certo número de repetições ela realizava uma torção em forma de grampo e permitia a formação do primer para o alongamento pela DNA polimerase, com posterior corte do grampo. Entretanto, após a descoberta de que o telômero possui realmente uma extremidade contendo DNA de fita simples preferiu-se a hipótese mais parcimoniosa de que a telomerase faria apenas uma das fitas e a outra seria completada pelo mecanismo de replicação de normal da célula.

Uma capacidade extra que as telomerases possuem é a de se mover ao longo do molde durante a síntese do DNA. Além disso, ela deve ser capaz dissociar-se do DNA recém-sintetizado e reposicionar o molde de RNA antes do próximo ciclo de síntese de DNA telomérico. Isso porque o DNA telomérico é formado por pequenas repetições seguidas de alguns poucos nucleotídeos (6, em humanos), e o RNA normalmente deve ser reposicionado para que as repetições sejam moldadas.

O RNA molde para transcrição reversa é normalmente maior do que apenas a seqüência da repetição telomérica. Entretanto, as extremidades desse molde devem ser precisamente definidas, de modo a assegurar que a repetição correta está sendo inserida. A extremidade 3’ deve ser definida tanto pelo alinhamento do molde ao DNA quanto pelo reconhecimento da extremidade livre pela TERT. A extremidade 5’ deve também ser altamente regulada para não permitir a cópia do resto do RNA. Em ciliados essa extremidade 5’ é muito conservada e consiste da seqüência GUCA, que está localizada dois nucleotídeos a 5’ do molde.

Portanto a telomerase deve ser uma enzima altamente flexível, tendo a capacidade de se movimentar ao longo do molde de RNA, do fim até o início facilmente. Para isso, a interação entre a enzima e o DNA deve ser bem fraca, de modo a permitir sua movimentação livre. Assim é formada uma pequena bolha de replicação e à medida que novos nucleotídeos são acrescentados, outros são despareados, permitindo que apenas um pequeno número deles fiquem interagindo por ligações Watson-Crick, economizando energia e permitindo uma flexibilidade a RNP – em humano apenas 11 ficam pareados de cada vez 12.

Telômeros e Câncer

Alguns trabalhos mostram que, quando a telomerase é inibido in vitro em células de câncer de mama e próstata através da inserção de RNA anti-senso, o encurtamento dos telômeros causa apoptose nas células. Entretanto, ao reunir muitos dos dados disponíveis, chega-se à conclusão de que os resultados causados pela perda do telômero são altamente dependentes do tipo celular que é utilizado. Algumas células podem entrar em senescência, outras ativarão o sinal de apoptose e outras continuarão a se replicar até um ponto no qual os telômeros serão tão pequenos que não poderão impedir certos rearranjos cromossômicos. Então, dependendo da resposta de um tipo celular a telômeros extremamente curtos, a sua ausência pode tanto promover quanto inibir a carcinogênese 13.

Telômeros e Senescência

A relação entre os telômeros e o envelhecimento celular ainda permanece incerta. Testes realizados em camundongos knock-out para o gene mTR, que codifica um componente essencial da telomerase, gerou animais que, em poucas gerações apresentavam fenótipos semelhantes aos causados pelo envelhecimento humano. Esses fenótipos foram também similares aos da síndrome de Werner, que leva ao envelhecimento prematuro, e da Diskeratose congênita (DKC), que é causada por uma deficiência na telomerase 6,13.

Telômeros e Clones Somáticos

A análise do tamanho dos telômeros de clones gerados através da transferência nuclear tem gerado algumas divergências. O primeiro desses clones, a ovelha Dolly, teve seu telômero medido quando tinha um ano de idade. A média do tamanho do telômero foi obtida por tratamento por enzimas de restrição e Dolly mostrou uma diminuição significativa do tamanho de seu telômero, quando comparado a uma ovelha de mesma idade (19,14 X 23,9 ± 0,18Kb). Essa diferença significativa mostrou que o telômero de Dolly é similar ao de uma ovelha com 6 anos, consistente com idade da ovelha doadora quando foram tiradas as células de sua glândula mamária, mais o tempo que essas células permaneceram em cultura antes da transferência nuclear 4.

A melhor explicação para a diminuição do telômero é que isso reflete a transferência nuclear ocorrida. Não se sabe se a idade fisiológica da ovelha está relacionada ao tamanho do telômero e o exame veterinário confirma que o animal encontra-se saudável e apresenta fenótipo típico de sua idade natal. Modelos teloméricos predizem que o telômero da Dolly pode alcançar o tamanho crítico mais cedo do que os controles. Entretanto, considerando o grande tamanho dos telômeros de ovelhas resta saber se isso acontecerá durante a vida de Dolly 4.

Esse resultado observado na Dolly gerou um certo tipo de frustração, pois a clonagem de órgãos poderia produzir versões muito velhas destes 5.

Entretanto, ao contrário do que foi visto na Dolly, bezerros clonados possuíam telômeros maiores do que o normal! Além disso, suas células mostravam outros sinais de juventude e podiam se dividir em cultura muito mais vezes do que células normais. Então os cientistas colocaram células de feto de bezerro em cultura e deixaram-nas envelhecer, quando elas estavam mostrando sinais de senescência, como aumento de tamanho e acúmulo de debris celulares, eles realizaram 1900 transferências nucleares com essas células e conseguiram produzir seis bezerros. Ao nascer os animais apresentaram-se maiores do que os normais, com alta pressão sanguínea e dificuldade de respiração, entretanto após dois meses já pareciam saudáveis e normais. Entre 5 a 10 meses de idade suas células foram analisadas e descobriu-se que seus telômeros eram maiores do que os controles normais de mesma idade e algumas vezes chegavam a ser maiores do que de fetos. Isso mostrou que os bezerros resetam os telômeros e parece que o oócito foi capaz de recuperar um estado de juventude ao núcleo recebido 5.

Entretanto, para saber se os animais vão viver mais se deve esperar, já que ovelhas vivem 12 anos e gado, 20. As diferenças com relação ao encontrado na Dolly podem ser aleatórias, devido a diferenças entre as espécies, tipos celulares ou métodos de transferência nuclear 5.

Leia também o texto sobre a estrutura dos telômeros

Os textos desse site podem ser reproduzidos total ou parcialmente, desde que o autor seja informado e receba os devidos créditos.
 
® Chico On Line. Prosdocimi, F. 2001-2.

 

Referências bibliográficas

1. Collins, K. Mammalian telomeres and telomerase. Current Opinion in Cell Biology 2000, 12:378-383.

2. Zakian, V. A. Telomeres: Begining to Understand the End. Science 1995, 270:1601-1607.

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5. Vogel, G. In contrast do Dolly, Cloning Resets Telomere Clock in Cattle. Science 2000, 288:586-587.

6. Kipling, D.; Faragher, R. G. A. Ageing hard or hardly ageing? Nature 1999, 398:191-192.

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8. Colgin, L. M.; Reddel, R. R. Telomere maintenance mechanisms and cellular immortalization. Current Opinion in Genetics & Development 1999, 9:97-103.

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10. de Lange, T. Telomeres and Senescence: Ending the Debate. Science 1998, 279:334-335.

11.  Prescott, J. C.; Blackburn, E. H. Telomerase: Dr Jekyll or Mr Hyde?. Current Opinion in Genetics & Development 1999, 9:368-373.

12. O’Reilly, M.; Teichmann, S. A.; Rhodes, D. Telomerases. Current Opinion in Structural Biology 1999, 9:56-65.

13. Marciniak, R. A.; Johnson, F. B.; Guarente, L. Dyskeratosis congenita, telomeres and human ageing. TIG 2000, 16(5): 193-195.

14. Stryer, L. Biochemistry. Ed. W H Freeman and Co. 4th ed. 1064p. 1995.

15. Suzuki, D. T. et al. Introdução à genética. Ed. Guanabara koogan. 6 ed. 856p. 1998.

 


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