Hiro Goto

Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo.

Departamento de Medicina Preventiva da Universidade de São Paulo.

José Angelo Lauletta Lindoso

Instituto de Infectologia Emílio Ribas.

Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo.

Várias protozooses constituem-se em grande problema de saúde pública no mundo e dentre elas a malária é a que traz maiores preocupações pela prevalência e morbidade, sendo incluída pela Organização Mundial da Saúde entre as seis endemias prioritárias para investimento em pesquisa. No Brasil a malária ao lado de leishmanioses estão em processo de expansão, porém o seu controle total pela intervenção no seu ciclo biológico é difícil ou não realizável, não só pelas condições sócio-econômicas da população sob risco, mas, porque envolvem elementos como insetos vetores cujo controle ou eliminação são racionalmente irrealizáveis. A vacina, portanto, é uma ferramenta que poderia contribuir efetivamente para esse controle.

Há muita pesquisa em desenvolvimento visando vacinas contra malária, porém, não temos ainda produtos liberados para uso na população geral. Há vários fatores que resultam nesta situação atual. Um dos fatores é decorrente da complexidade do ciclo biológico onde o parasito toma formas morfológicas diversas. Este fato leva ao envolvimento de antígenos diversos nas várias fases do ciclo. Além disso os parasitos têm a capacidade de modificar as moléculas de seus antígenos, variação antigênica, diante de uma resposta imune protetora, embora esta não seja privilégio de protozoários. Utilizam-se ainda de diversos mecanismos para evadir da resposta imune protetora do hospedeiro entre eles de proliferar dentro de células dificultando acesso, por exemplo, por anticorpos. Na pesquisa constatam-se que os antígenos dos parasitos são complexos e, quando se chega a algum produto para teste, nem sempre o sistema experimental para teste, seja in vitro ou in vivo em animal de laboratório, não é disponível ou o seu paralelismo no homem é questionável. Algumas vezes ocorre também limitação na possibilidade de produção em grande escala, por exemplo, crescimento de parasito em quantidade grande. Uma outra questão é quanto a possibilidade de manutenção da resposta protetora por período prolongado após imunização. Na malária esta questão é uma incógnita, pois, nas áreas endêmicas, nos indivíduos com infecções repetidas, não se observa imunidade esterilizante.

Quando um candidato a vacina passa por testes em sistemas in vitro ou in vivo em animal de laboratório e sua eficácia é comprovada, o produto passa por testes clínicos em três fases. Na fase I testa-se a segurança, isto é, a existência de toxicidade ou efeitos colaterais, na fase II, imunogenicidade em um número restrito de indivíduos e na fase III, a eficácia contra infecção natural no campo.

Apresentaremos neste artigo resultados de pesquisas na malária com ênfase nos produtos ou linhas de pesquisa que resultaram em candidatos a vacina e testados em ensaios clínicos.

Malária e pesquisas de vacina contra malária

Malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium e constitui-se na doença parasitária humana de maior prevalência. Estima-se que quatro bilhões de pessoas de aproximadamente 90 países diferentes estão sob risco de adquirir a malária, cerca de 500 milhões de casos ocorrem a cada ano, levando à morte 1-2  milhões de indivíduos, principalmente crianças com menos de 5 anos de idade¹. São quatro as espécies que infectam o homem: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale . No Brasil a malária é endêmica nas regiões tropicais, estima-se que cerca de 6 milhões de pessoas estejam sob risco de contrair a malária e em 1997, 405.051 casos foram diagnosticado². As espécies envolvidas são P. falciparum, P. vivax e P. malariae, mas as duas primeiras são as que despertam maior preocupação pela freqüência e/ou pela gravidade da doença.

Vários fatores dificultam o controle desta endemia tais como o meio ambiente na cercania das florestas onde a infecção é prevalente, condições sócio-econômicas precárias da população, a ineficácia dos inseticidas para o controle dos vetores e a resistência dos parasitos a drogas anti-maláricas. A vacina, portanto, constitui-se numa alternativa importante para o controle. Várias linhas de pesquisa são perseguidas e várias estratégias experimentadas na tentativa de suplantar as dificuldades impostas pela complexidade dos fatores envolvidos na infecção pelo Plasmodium.

O ciclo de vida do Plasmodium por si só é bastante complexo. Durante o ciclo de vida do Plasmodium, o inseto vetor anofelino adquire a forma sexuada do parasito, o gametócito, ao sugar o sangue do homem infectado. O gametócito gera no tubo digestivo do inseto o gameta que evolui para oocineto, oocisto e esporozoito. O esporozoito matura na glândula salivar do inseto e é injetado no homem no momento do repasto sangüíneo. Uma vez injetado, o esporozoito permanece cerca de 30 minutos na corrente sangüínea antes de entrar no hepatócito ou ser eliminado por outras células. A entrada no hepatócito é uma etapa crucial para a evolução da infecção; no período de cerca de uma semana ocorre multiplicação intracelular do parasito, fenômeno conhecido como esquizogonia. A multiplicação do parasito é assombrosa resultando na geração de cerca de 30 000 merozoitos a partir de um único esporozoito. Os merozoitos liberados seguem o seu curso infeccioso invadindo agora as hemácias, iniciando o ciclo eritrocítico; em 2 a 3 dias, de cada merozoito que invade a hemácia, seis a 24 merozoitos são gerados e que continuam seu ciclo infeccioso invadindo novas hemácias. As manifestações clínicas da malária são ligadas ao ciclo eritrocítico. Esta visão do ciclo do parasito é um passo importante para identificar os pontos onde o Plasmodium pode ser alvo de ataque de elementos efetores do sistema imune. As pesquisas voltam-se basicamente para : a) fase pré-eritrocítica, isto é do momento da infecção com o esporozoito até a fase de liberação de merozoitos pelos hepatócitos; b) fase eritrocítica e c) fase de transmissão, ou para as formas sexuadas do Plasmodium.

Para o desenvolvimento de qualquer vacina o ponto de partida é a constatação da possibilidade de induzir imunidade no hospedeiro contra a infecção em questão. Na malária esta evidência foi verificada há cerca de 30 anos em animais experimentais e no homem imunizados com esporozoitos irradiados^3,4, porém, não sendo factível o uso de esporozoitos irradiados como vacina, pela impossibilidade de produção em grande escala de esporozoitos dentre outras questões práticas, inicia-se a busca de outros imunógenos obtidos utilizando tecnologias bioquímicas e de biologia molecular avançadas, busca esta que continua até os dias atuais. Vacinas voltadas para a fase pré-eritrocítica que tem o esporozoito como alvo ou que impeçam a invasão do hepatócito pelo parasito ou ainda que o eliminem durante a esquizogonia dentro do hepatócito são interessantes por bloquear a infecção no seu início, porém, a sua eficácia há de ser absoluta considerando que escape de um único parasito pode levar à fase eritrocítica da infecção com suas conseqüências patológicas. Ao lado de estudos visando esta fase pré-eritrocítica, duas outras linhas de pesquisa são desenvolvidas tendo como alvo a fase eritrocítica e o bloqueio da transmissão, esta última visando impedir o desenvolvimento do parasito dentro do inseto vetor com indução de anticorpo no hospedeiro que teria efeito dentro do tubo digestivo do inseto, interferindo na reprodução do parasito.

Na busca de imunógenos candidatos à vacina, principalmente quando se buscam moléculas sintéticas, o conhecimento do mecanismo imune protetor é essencial. Os conhecimentos neste campo ainda não são completos e às vezes contraditórios, porém, é consenso que tanto a imunidade celular quanto a humoral são importantes na proteção. Um aspecto importante é que as hemácias onde se processa a maior parte do ciclo do Plasmodium no hospedeiro vertebrado não têm moléculas do complexo principal de histocompabilidade que são fundamentais na apresentação do antígeno ao sistema imune; no ciclo, somente hepatócito que participa na fase inicial da infecção tem as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade, portanto, com capacidade de apresentação de antígeno.

Inicialmente, porções de moléculas imunogênicas (epítopos) da superfície do esporozoito visando desenvolvimento de imunidade humoral, isto é ativação de linfócitos B, foram pesquisados, mas, recentemente estratégias para induzir imunidade celular estão em estudo, principalmente com o uso de adjuvantes diversos. Epítopos de antígenos de fases diferentes do ciclo do Plasmodium foram identificados e inicialmente estudados isoladamente, porém, mais recentemente são formulados compostos com vários epítopos de diversas fases do ciclo. A seguir veremos os epítopos mais estudados isoladamente e em combinação com outros e em várias fases de teste em seres humanos. São poucos os candidatos a vacina testados até a fase III. Ressaltamos que a grande maioria dos estudos é com a espécie P. falciparum, porém, pela importância do P. vivax no nosso meio, apresentaremos alguns dados no final desta revisão.

A proteína que cobre o esporozoito é conhecida como “circunsporozoite protein” (CSP) e o epítopo B imunodominante desta proteína é  a porção central repetitiva NANP encontrada no P. falciparum, mas, presente e conservada nas diversas espécies de Plasmodium. O gene da CSP foi clonado⁵ e, subseqüentemente, foram obtidos produtos recombinantes⁶ e sintéticos⁷ considerados seguros para uso em seres humanos, porém, estudos clínicos não mostraram proteção além de 20 – 30% ^6,8,9 e em três testes em campo também não se observou proteção com o uso de vacinas baseadas no epítopo NANP ¹⁰. Recentemente, uma formulação que consiste de proteína de fusão de uma porção da CSP e antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), denominada RTS.S, foi testada em voluntários humanos com adjuvantes diversos e imunoestimulantes.  Resultados iniciais com RTS.S em emulsão água – óleo acrescida de imunoestimulantes monofosforil lipídio A e QS21 despertaram entusiasmo por conferir proteção em seis dos sete indivíduos vacinados quando desafiados com mosquito infectado por P. falciparum três semanas após a terceira dose da vacina¹¹. No entanto, quando cinco destes indivíduos e outros dois que receberam outro tipo de adjuvante e que mostraram proteção inicial foram desafiados novamente após 6 meses, cinco desenvolveram infecção¹², abortando prosseguimento para a fase III.

Epítopos da fase eritrocítica também são objeto de intenso estudo e há 25 anos foi observada proteção de macacos injetados com merozoitos de P. knowlesi e P.falciparum utilizando adjuvante completo de Freund^{13, 14}. Proteína 1 da superfície de merozoito  (“merozoite surface protein” – MSP-1) de P. yoelii foi purificada com anticorpo monoclonal e esta induziu imunidade em camundongo contra a infecção com o parasito homólogo¹⁵; proteína homóloga de MSP-1 também foi encontrada em outras espécies de Plasmodium incluindo P. falciparum ¹⁶. Utilizando proteína de fusão MSP-1 - glutationa S transferase foi possível proteger camundongo à infecção por P. yoelii¹⁷ e MSP-1 recombinante de P. falciparum induziu proteção em  macacos Aotus¹⁸. Proteína de fusão de MSP-1 e epítopo T do toxóide tetânico foi para teste de fase I em seres humanos e observaram-se algumas reações adversas, recomendando-se maior cautela no uso¹⁹. Uma outra proteína da fase eritrocítica em estudo é o antígeno apical 1 de membrana (“apical membrane antigen” – AMA-1). AMA-1 na forma de proteína nativa conferiu imunidade em macacos contra infecção homóloga²⁰ e proteína recombinante AMA-1 de P. fragile protegeu parcialmente macacos contra infecção homóloga e também contra P. falciparum²¹.

O epítopo visando o bloqueio da transmissão em fase mais avançada de estudo é o Pf25 ²² que está em teste em seres humanos.

Nessas pesquisas com epítopos diversos, estudados isoladamente, constataram-se vários obstáculos entre eles a diversidade antigênica e a evasão do parasito dos mecanismos protetores imunes do hospedeiro. Dependendo da proteína observam-se variações entre diferentes linhagens de parasitos da mesma espécie agravadas pelo fato de não desenvolverem reatividade imune cruzada no hospedeiro para as variantes. Outras observações preocupantes são que as porções mais conservadas entre as várias espécies do Plasmodium e entre os isolados não serem importantes para a proteção, que o epítopo dominante não ser imunogênico e, em outros casos, que as porções imunogênicas não serem acessíveis ao sistema imune. Para contornar essas questões estão em estudo vários compostos que combinam múltiplos epítopos.

Constatando-se que a imunidade dirigida exclusivamente a uma fase do ciclo do parasito dificilmente levaria a uma proteção efetiva, vários compostos combinando epítopos de diferentes fases do ciclo do parasito foram elaborados para estudo. Um desses compostos é o composto com múltiplos peptídeos do antígeno (“multiple antigen peptide” = MAP) constituído por vários epítopos para células T e B da CSP e foi avaliado em camundongos e três espécies de macaco Aotus²³. Neste estudo, MAP com o adjuvante hidróxido de alumínio (que pode ser utilizado no homem) não suscitou produção esperada de anticorpos anti-Plasmodium, porém, o nível de anticorpos aumentou no macaco que tinha sido imunizado previamente com esporozoito, indicando talvez a sua utilidade em indivíduos da área endêmica com história prévia de episódios de malária e com níveis baixos de anticorpos. Uso concomitante de imunoestimulante QS-21 aumentou a imunogenicidade do composto, sugerindo-se o seu uso quando do teste em seres humanos.

Outras formulações com compostos múltiplos têm na composição epítopos de várias fases do ciclo do parasito. O mais estudado é o SPf66, desenvolvido na Colombia, que contém a seqüência PNAMP do CSP da fase pré-eritrocítica e três antígenos da fase eritrocítica incluindo um epítopo do MSP-1, que mostrou efeito protetor parcial quando testado no macaco e em voluntários humanos^{24, 25}. No entanto, resultados de teste em campo são controversos. Recentemente, todos os testes em campo foram analisados por dois revisores independentes e concluiu-se que não houve proteção a P. falciparum na África, houve redução modesta de ataques de malária por P. falciparum em outras regiões, mas, não foi constatado efeito na incidência do primeiro ataque por P. falciparum¹⁰.

Numa abordagem diferente da obtenção simples de proteínas recombinantes para uso como vacina, alguns compostos são resultantes de inserção de segmentos de gene que codificam para proteínas do parasito de interesse em microrganismos que por si só suscitam resposta imune que possam contribuir na imunização com o composto vacinal. Uma destas preparações é o NYVAC-Pf7 que não só associa epítopos de fases diferentes do ciclo do parasito, mas, estes são expressos pelo vírus da vaccinia NYVAC. Foram inseridos neste vírus genes que codificam para proteínas expressas por parasitos na fase de esporozoito (CSP e PfSSP2), fases hepática (LSA1), eritrocítica (MSP1, SERA, AMA1) e sexuada (Pfs25). Não tendo observado nenhum efeito colateral da NYVAC-Pf7 em macaco Rhesus, foi testado em voluntários humanos em teste de fases I e II. Houve indução tanto da resposta humoral quanto celular a diferentes componentes antigênicos, mas, somente retardou o aparecimento da parasitemia, não induzindo proteção²⁶.

Nesta mesma linha, uma preparação nova, ainda na fase de teste pré-clínico, foi obtida com a construção de um gene sintético que codifica para 21 epítopos do antígeno de P. falciparum, gene este expresso em baculovírus. A proteína purificada resultante deste processo é denominada de CDC/NIIMALVAC –1²⁷. Os epítopos são das fases de esporozoito, da passagem pelo hepatócito, fases eritrocítica e sexuada e 12 epítopos são para células B, seis para células T proliferativas e três para células T citotóxicas. Quando coelhos foram imunizados com esta vacina, produziram anticorpos para diversos epítopos da vacina e para o esporozoito, hemácia infectada e gametócito sendo os níveis mais baixos para essas últimas formas. O soro de coelhos vacinados diminuiu bastante a infecção de hepatócito in vitro.

Vacina de DNA é uma outra possibilidade explorada tendo como vantagem a facilidade na sua obtenção e indução de resposta de células T, principalmente CD8⁺ além da persistência no hospedeiro com estimulação imune por período prolongado. DNA de CSP de P. yoelii (PyCSP) foi testada em camundongos BALB/c conferindo proteção parcial dependente de células T CD8⁺ e, recentemente, DNA de CSP de P. falciparum foi testada em voluntários humanos quanto à toxicidade e segurança. Num estudo em que se combina o uso de DNA de PyCSP e um recombinante constituído por vírus da vaccinia contendo segmento de gene de PyCSP observa-se melhor proteção e produção maior de anticorpos com o uso inicial de DNA seguido de recombinante como reforço do que o uso de duas doses de vacina de DNA²⁸.

No nosso meio P. vivax é uma espécie importante do ponto de vista epidemiológico pela frequência, porém, os estudos para o desenvolvimento de vacina com esta espécie de Plasmodium ocorrem numa escala mais modesta. Os estudos mais avançados são de testes em várias espécies de primatas não humanos com diferentes compostos vacinais. O primeiro teste em primata foi com esporozoito irradiado e com o antígeno recombinante de CSP de P. vivax, observando-se produção de anticorpos e proteção em alguns e prolongamento do período prepatente em outros²⁹. Dois peptídeos derivados de CSP de P. vivax foram também testados utilizando alum como adjuvante obtendo-se proteção com um deles³⁰. Recentemente, macacos imunizados com composto MAP de P. vivax desenvolveram tanto resposta humoral quanto celular com produção de interferon gama³¹. Imunogenicidade de peptídeos da proteína da fase eritrocítica MSP-1 de P. vivax foi estudada³² e recentemente no modelo de primata infectado com P. cynomolgi, considerado similar a infecção humana por P. vivax, foi utilizado antígeno recombinante de MSP-1 de P. cynomolgi em baculovírus obtendo-se proteção grande que não se alterou após seis meses³³.

Temos que admitir que o que temos no momento ainda não é satisfatório para a solução do problema de saúde pública, porém, mostramos as principais linhas de pesquisa no desenvolvimento da vacina contra malária para se chegar a essa etapa de desenvolvimento e para podermos avaliar a complexidade do problema.

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